2.2 Chromosomenpräparation

Die etablierte Methode zur Präparation der Polytänchromosomen aus dem Embryosuspensor von Phaseolus coccineus (Schumann et al. 1990; Nenno 1992; Nenno et al. 1994; Nagl 1996) wurde in einigen Details weiterentwickelt, um die Chromosomen besser zu spreiten.

Dazu war es notwendig, jeden einzelnen Zellkern, vor dem Spreiten der Chromosomen aus der Zelle, freizulegen und einer zusätzlichen Mazeration in Essigsäure zu unterziehen. Ferner wurde der erste Wässerungsschritt des fixierten Materials sowie alle anschließenden zeitlich deutlich ausgedehnt.

Die Beschichtung der Objektträger mit Poly-L-Lysin erfolgte nach der Methode von Huang et al. (1983).

Material, Chemikalien und Lösungen
Kälteplatte (FTS Systems)
Stereomikroskop mit Durchlicht, 0,8-6,4fach, STEMI SV8 (Zeiss) und Phasenkontrast-Mikroskop (Zeiss)
MES (2[N-Morpholino] ethanesulfonic acid) (Sigma, M-3023)
Poly-L-Lysin(M_w 300.000, Sigma, P-1524)-Lösung, 1 mg/ml in Aqua dest.
Sucrose (SERVA, 35580)
Pektinase (Fluka, 76290)
Propionsäure, 99.5%
Milchsäure, DL-Lactic acid (Serva)
MES-Sucrose-Puffer: 25 mM MES mit 6% (w/v) Sucrose, pH 5,5
Pektinase-Gemisch: 10% (w/v) Pektinase in MES-Sucrose-Puffer

Durchführung

Vorbereitung

• um 6-8 Präparate herzustellen, werden die Suspensoren von ca. 60-80 Samen benötigt
• fixierte und bei -20°C aufbewahrte Samen in 70% Ethanol (RT) überführen und auf RT bringen
• Ethanol durch mehrmaliges Mischen der Lösung mit Aqua dest. im Verhältnis 50:50 auswaschen, bis die Samen beim Schütteln keine Schlieren mehr ziehen und sich am Boden absetzen
• unter dem Stereomikroskop die Samenschale mit einem Oberflächenschnitt von der Mitte des Samens in Richtung Mikropyle bis zur äußeren Samenschale hin öffnen
• den Embryosuspensor mit möglichst wenig umliegendem Gewebe - im folgenden als "Gewebestück" bezeichnet - herauspräparieren (siehe Abbildung)

• Gewebestücke sammeln, 2 mal in Aqua dest. spülen und über Nacht bei +4°C aufbewahren

• aus den Gewebestücken letzte Reste von Ethanol mit Aqua dest. herausspülen
• enzymatische Mazeration der Gewebestücke in 20 ml 10% Pektinase-Lösung für 3 h bei 37°C in einem Inkubationsschüttler bei 120 rpm
• nach dreimaligem Waschen in Aqua dest. die Gewebestücke für 3 h in 10 ml Propionsäure-Milchsäure-Gemisch (1:1) bei RT nachfixieren
• Fixiergemisch durch mehrmaliges Ersetzen von jeweils der Hälfte der Lösung durch Aqua dest. auswaschen, bis die Gewebestücke beim Schütteln keine Schlieren mehr ziehen
• Gewebestücke für weitere 24 h bei +4°C aufbewahren

• mehrere Gewebestücke in einen großen Tropfen 45% Essigsäure auf einen Hohlschliff-OT überführen und die Suspensorzellen vereinzeln
• nur die größten Suspensorzellen mit sehr klarem Cyto- und Nukleoplasma und nicht zu stark kondensierten Chromosomen aussortieren
• 10-20 Zellen mit einer 20 µl-Pipette (mit abgeschnittener Spitze) in einem Tropfen 45% Essigsäure auf einen weiteren Hohlschliff-OT überführen
• Jede einzelne Zelle zunächst durch behutsames Drücken mit Präpariernadel und Pinzette öffnen, wobei ihr Inhalt langsam herausquillt. Durch erneutes vorsichtiges Drücken den Inhalt von der Zellwand befreien (Abbildung unten). Nach der Größe des Bereiches zu schließen, den die Chromosomen in dem herausgequetschten Zellinhalt ausmachen, besteht er zum überwiegenden Teil aus dem Zellkern.

• Zellkern, auf einen weiteren Hohlschliff-OT in einen großen Tropfen 45% Essigsäure übertragen und weitere (ca. 12) solcher Zellkerne darin sammeln
• Die Kerne 15 bis 20 min in der Essigsäure mazerieren, um das viskose und gallertartige Nukleoplasma etwas aufzulösen bzw. flüssiger zu machen
• die Kerne auf einen Poly-Lysin-beschichteten OT übertragen, ein DG aufgelegen und mit einem Stück Filterpapier abdecken
• die Zellkerne mit der Rückseite einer Präpariernadel durch leichtes Klopfen leicht quetschen, was zu einer Vereinzelung der Chromosomen führt
• Qualität der Präparation im Phasenkontrast (40x) kontrollieren
• das Präparat auf einer Kälteplatte bei -70°C einfrieren und das DG anschließend mit einer Rasierklinge gemäß der Trockeneis-Methode nach Conger und Fairchild (1953) "absprengen"
• Präparate in 99% Ethanol entwässern und über Nacht an der Luft trocknen
  Die Abbildung zeigt einen OT vor schwarzem Hintergrund, auf dem 12 gequetschte "Zellkerne" zu erkennen sind

• Präparate sollen vor dem weiteren Gebrauch mindestens 3 bis 4 Tage bei RT lagern