Für die FISH mit DNA-Sonden können sich zwei Bestandteile in den Chromosomenpräparaten als störend erweisen. Dies sind zum einen die verschiedenen Bestandteile des Nukleoplasmas (z. B. Proteine), die die Chromosomen überlagern und ebenso wie chromosomale Proteine die die ISH und nichtradioaktive Detektion erschweren können (Nenno et al. 1994). Zum anderen können auch Reste von RNA im Präparat hinderlich sein, weil die Sonden potentiell auch mit ihnen hybridisieren können und sie damit eine Quelle von falschpositiven Signalen darstellen.
Die Chromosomenpäparate wurden daher mit der Protease Pepsin oder alternativ mit Proteinase K sowie mit RNase A vorbehandelt, um die störenden Bestandteile zu entfernen (Dr. H. Scherthan, persönliche Mitteilung). Die hier angewendeten Protease- und RNase-Vorbehandlung basiert auf dem Protokoll von Nenno (1992).
Material, Chemikalien und Lösungen
20 x SSC: 3 M NaCl, 0,3 M Na3-Citrat*2H20, pH 7,0
PBS: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na2HPO4, 1,4 mM
KH2PO4, pH 7,3
Proteinase K-Inkubationspuffer: 20 mM Tris-HCl pH 8,0, 2 mM
CaCl2
Proteinase K-Gebrauchslösung: 100 µg/ml in
Proteinase K-Inkubationspuffer
Proteinase K-Stoppuffer : 20 mM Tris-HCl pH 8,0, 2 mM CaCl2, 50 mM
MgCl2
Pepsin porcine, 17 milliAnson U/mg, 2 x cryst. lyophil (Serva)
Pepsin/HCl-Lösung: 1 mg Pepsin/ml in 0,05 M HCl
Proteinase K, lyophilisiert (Boehringer Mannheim, 745 723)
RNase-Lösung: 100 µg/ml RNase A, DNase-frei in 1 x SSC
Pepsin/HCl
Die Vorbehandlung mit Pepsin/HCl wurde wie von Nenno (1992) und Nenno et al. (1994) beschrieben durchgeführt. Die Konzentration der HCl-Lösung wurde jedoch von 0,01 M auf 0,05 M erhöht um die Nukleoplasmabestandteile noch stärker abzubauen.
Durchführung
Proteinase K (alternative zu Pepsin)
Gegenüber dem Protokoll von Nenno (1992) wurde die Konzentration der Proteinase K von 1 mg/ml auf 100 µg/ml reduziert, um die Morphologie der Chromosomen nicht zu stark zu beeinträchtigen.
Durchführung
Durchführung