2.5 DNA-Sonden

• 2.5.1 Sonden aus klonierten DNA Sequenzen
  • 2.5.1.1 Sondenherstellung aus Plasmid-Klonen und Markierung
  • 2.5.1.2 Sondenherstellung und Markierung mittels PCR
• 2.5.2 Synthetische Oligonukleotide als DNA-Sonden
  • 2.5.2.1 Endmarkierte Oligonukleotide
  • 2.5.2.2 Tailing von Oligonukleotiden
• 2.5.3 Ethanolfällung und Überprüfung der Einbaueffizienz

Hybridisierungen wurden sowohl mit Sonden von klonierten DNA-Sequenzen für kodierende Gene als auch mit synthetischen Oligonukleotiden für verschiedene Mikrosatelliten, auch "simple sequence repeats" oder "SSRs" genannt, durchgeführt.

Soweit nicht anders gekennzeichnet, wurden alle Antikörper, Enzyme, gekoppelte Nukleotide, Kontroll-DNA und Kits von der Firma Boehringer Mannheim bezogen.

2.5.1 Sonden aus klonierten DNA Sequenzen

Als DNA-Sonden für die Gene der ribosomalen 18S, 5,8S und 25S (18S-25S) sowie 5S RNA und die Phaseolin-Gene wurden klonierte Sequenzen aus Plasmid-Klonen eingesetzt (Tabelle 2). Die Klone zur Sondenherstellung wurden von folgenden Personen dankenswerterweise zur Verfügung gestellt: pTa250: Prof. Dr. N. Blin (Universität des Saarlandes, Homburg), pTa794: Dott. I. Galasso (Istituto del Germoplasma, Bari, Italien) und AG-pPvPh3.0: Prof. J.L. Slightom (Michigan, USA).

Tabelle 2: Liste der verwendeten klonierten Sequenzen und Plasmid-Klone

2.5.1.1 Sondenherstellung aus Plasmid-Klonen und Markierung

Bakterienanzucht und Plasmidisolation

Die Bakterienanzucht und Plasmidisolation zur Herstellung der Sonden für die 18S-25S rDNA und Phaseolin wurden gemäß Standardtechniken durchgeführt (Sambrook et al. 1989). Dazu wurden die entsprechenden Klone zunächst unter Antibiotika-Selektion in Luria-Bertani(LB)-Medium angezogen. Anschließend erfolgte eine Lyse in NaOH/SDS in Gegenwart von RNase A (Birnboim und Doly 1979),(Birnboim 1983) um die Bakterien aufzuschließen. Sodann wurde die Plasmid-DNA über eine Silica-Säule gemäß dem "Maxi-Plasmid Purification Protocol" des verwendeten Isolations-Kits (Qiagen) rückgewonnen und aufgereinigt.

Markierung mit Biotin bzw. Digoxigenin

Die Markierung der Plasmid DNA mit Biotin erfolgte nach dem Verfahren der Nick-Translation (Rigby et al. 1977) mit einem Nick-Translation-Kit. Anschließend wurde die markierte Sonden-DNA, wie unter 2.5.3 beschrieben, mit Ethanol gefällt.

Material, Chemikalien und Lösungen
Biotin-16-dUTP , 0,4 mmol/l
dTTP, dATP, dCTP, dGTP je 0,4 mmol/l (Nick Translation Kit)
10x Nick Translation Puffer (Nick Translation Kit)
Enzymmischung: DNA Polymerase I und DNase I in 50% (v/v) Glycerin (Nick Translation Kit)
EDTA, 0,2 M, pH 8,0

Durchführung

• Herstellung eines dNTP-Gemisches aus: 1 Vol. Biotin-16-dUTP, 2 Vol. dTTP, 3 Vol. dATP, 3 Vol. dCTP und 3 Vol. dGTP
• Folgende Bestandteile werden in einem Reaktiongefäß gemischt und anschließend mit sterilem, Aqua dest. auf 18 µl aufgefüllt: 0,1 - 2 µg gereinigte Plasmid-DNA, 10 µl dNTP-Gemisch und 2 µl 10x Puffer
• Dem Reaktionsansatz 2 µl Enzymmischung hinzufügen und 90 min bei 15°C inkubieren
• Markierungsreaktion stoppen durch Zugabe von 2 µl EDTA und Erwärmen auf 65°C

Digoxigenin-Markierung

Zur Markierung der Sonden mit Digoxigenin-11-dUTP wurde das DIG-High-Prime-Kit verwendet. Das dabei verwendete Verfahren der "random primed" DNA-Markierung basiert auf der Methode von Feinberg und Vogelstein (1983; 1984). Die Fällung der markierten Sonden-DNA erfolgte wie unter 2.5.3 beschrieben.

Material, Chemikalien und Lösungen
DIG-High-Prime-Gemisch (DIG-High Prime Kit)
EDTA, 0,2 M, pH 8,0

Durchführung

• 1 µg gereinigte Plasmid-DNA in einem 1,5 ml Reaktionsgefäß mit sterilem Aqua dest. auf ein Endvolumen von 16 µl auffüllen
• Plasmid-DNA durch 10 minütiges Erhitzen in einem Wasserkocher denaturieren und schnell in einem Eis/Ethanol-Gemisch abschrecken
• 4 µl DIG-High Prime zugeben, mischen und kurz zentrifugieren
• Gemisch für 20 h bei 37°C inkubieren
• Reaktion stoppen durch Zugabe von 2 µl EDTA und Erhitzen auf 65°C

2.5.1.2 Sondenherstellung und Markierung mittels PCR

Die Sonde zum Nachweis der 5S ribosomalen RNA Gene wurde durch Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) unter Verwendung des Klons pTa794 als Template-DNA und dem Einbau von Biotin- bzw. Digoxigenin-markierten Nukleotiden hergestellt.

Material, Chemikalien und Lösungen
PCR-Cycler (DNA Thermal Cycler 480, Perkin Elmer)
10x PCR Puffer: 100 mM Tris-HCl, pH 8,3; 500 mM KCl; 30 mM MgCl₂, 0,1% (w/v) Gelatine
unmarkierte Nukleotide: jeweils 2 mM dATP, dCTP, dUTP in 100 mM Tris-HCl, pH 7,5
Digoxigenin-11-dUTP, 1 mM
Biotin-11-dUTP, 0,4 mM (Sigma)
pBR322 Primer-1: Bam HI Sequenzierungs-Primer, clockwise (Promega)
pBR322 Primer-2: Bam HI Sequenzierungs-Primer, counterclockwise (Promega)
Taq-Polymerase: 5 U/µl
DNA: pTa794, 20 ng/µl
Mineralöl (Sigma)
0,5 ml Reaktionsgefäße für PCR
Na-Acetat
TE-Puffer: 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA pH 8,0

Durchführung

• Zusammenstellen von drei Reaktionsansätzen (Tabelle 3):

Tabelle 3: PCR-Reaktionsansätze

• Reaktionsansätze mischen, kurz zentrifugieren und jeweils mit 1-2 Tropfen Mineralöl überschichten
• Auf einem PCR-Cycler folgendes Programm festgelegen:
  • 5 min Denaturierung bei 93°C
  • 35 Zyklen von:
    • 0,5 min Denaturierung bei 94°C
    • 0,5 min Annealing bei 56°C
    • 1,5 min Elongation bei 72°C
  • 5 min bei 72°C
  • abkühlen lassen bei 4°C
• Reaktionsansätze vorsichtig unter dem Mineralöl abziehen

Fällen der DNA

• zu jeweils 45 µl Reaktionsansatz 5 µl kaltes 3 M Na-Acetat und 100 µl eiskalten abs. Ethanol geben
• zum Fällen über Nacht bei -20°C stellen
• 30 min zentrifugieren mit 13.000 x g bei +4°C
• Niederschlag zweimal mit 70% kaltem Ethanol waschen, an der Luft trocknen lassen und in jeweils 20 µl TE-Puffer lösen

2.5.2 Synthetische Oligonukleotide als DNA-Sonden

2.5.2.1 Endmarkierte Oligonukleotide

Die verwendeten Oligonukleotide (Tabelle 4) wurden von der Firma Biometra (Göttingen) synthetisiert und waren am 5'-Ende mit Digoxigenin markiert. Die Basenabfolgen der in Tabelle 4 angegebenen Core-Konsensus-Sequenzen für die Minisatelliten M13 und das 33bp Repeat wurden den Arbeiten von Vassart et al. (1987) bzw. Jeffreys et al. (1985) entnommen. Die Telomer-Sequenz (TTTAGGG)₅ aus Arabidopsis thaliana wurde von Richards und Ausubel (1988) übernommen.

Tabelle 4: Liste der als DNA-Sonden eingesetzten synthetischen Oligonukleotide

2.5.2.2 Tailing von Oligonukleotiden

Die beiden Oligonukleotide (C)₁₆ sowie die Telomer-Sequenz (TTTAGGG)₅ wurden auch unmarkiert bezogen und am 3'-Ende mit Hilfe eines DIG-Oligonukleotide-Tailing-Kit (Boehringer Mannheim) nach Angaben des Herstellers markiert. Die Reportermoleküle für die Markierung bestanden dabei entweder aus Digoxigenin-11-dUTP, Biotin-16-dUTP oder FITC-12-dUTP. Die Fällung der markierten Oligonukleotide erfolgte wie unter 2.5.3 ausgeführt.

Material, Chemikalien und Lösungen
Reaktions-Puffer, 5 x konz.:
1 M Kaliumkadodylat; 0,125 M Tris-HCl, 1,25 mg/ml BSA, pH 6,6
DIG-11-dUTP, BIO-16-dUTP oder FITC-12-dUTP jeweils 1 mM
Terminale Transferase-Lösung: 50 U/µl in 0,2 M Kaliumkadodylat, 1 mM EDTA, 200 mM KCl und 0,2 mg/ml ml Rinderserumalbumin, pH 6,6
Glykogen-EDTA-Lösung: 1 µl Glykogen-Lösung (20 mg/ml) und 200 µl 0,2 M EDTA pH 8,0

Durchführung

• Folgende Komponenten in einem Reaktionsgefäß auf Eis mischen: 4 µl Reaktions-Puffer, 4 µl 25 mM CoCl₂, 1 µl Oligonukleotid (100 pmol), 1 µl DIG-11-dUTP (oder Bio-16-dUTP bzw. FITC-12-dUTP), 1 µl 20 mM dATP und 1 µl Terminale Transferase-Lösung
• Ansatz mit sterilem, Aqua dest. auf 20 µl auffüllen und mischen
• Markierungsreaktion 15 min bei 37°C durchführen und dann auf Eis stellen
• Reaktion durch Zugabe von 2 µl Glykogen-EDTA-Lösung stoppen

2.5.3 Ethanolfällung und Überprüfung der Einbaueffizienz

Ethanolfällung der Sonden-DNA

Die Sonden wurden nach der Markierung mit Ethanol gefällt. Die zugrundeliegenden Anweisungen entstammen Sambrook et al. (1989) und dem Protokoll aus dem DIG-High-Prime-Kit.

Material, Chemikalien und Lösungen
Ethanol, abs., auf -20°C vorgekühlt
Ethanol, 70%, auf -20°C vorgekühlt
4 M LiCl
TE-Puffer: 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA pH 8,0

Durchführung

• dem 20 µl-Markierungs-Ansatz 2,5 µl 4 M LiCl und 75 µl abs. Ethanol zugeben und gut mischen
• DNA über Nacht bei -20°C fällen
• 15 min mit 13.000 x g bei +4°C zentrifugieren
• Überstand verwerfen und Niederschlag mit 70% Ethanol waschen
• Überstand verwerfen und Niederschlag an der Luft trocknen lassen
• Niederschlag in entsprechendem Volumen TE-Puffer bzw. sterilem, Aqua dest. aufnehmen, so daß sich eine Endkonzentration 50 ng/µl (klonierte Sequenzen) bzw. 10 pmol/µl (Oligonukleotide) ergibt

Überprüfung der Einbaueffizienz der markierten Sonden

Um zu testen, ob die Markierung der Sonden ausreichend hoch ist um später eine Detektion zu ermöglichen, wurde die Einbaueffizienz der markierten Nukleotide in die Sonden-DNA geprüft. Das unten genannte Protokoll ist eine Modifikation des Protokolls aus dem "DIG DNA Labeling and Detection Kit Nonradioactive" (Nr. 1093 657, Boehringer Mannheim). Durch den gleichzeitigen Einsatz von Antikörpern für Biotin und Digoxigenin lassen sich auch verschieden markierte Sonden simultan testen.

Material, Chemikalien und Lösungen
Nylon-Membran: Hybond-N (Amersham)
Biotin-markierte Kontroll-DNA: DNA-Längenstandard II, Biotin-markiert
Digoxigenin-markierte Kontroll-DNA: linearisierte pBR328 DNA
TE-Puffer: 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 8,0
DIG-Puffer-1: 100 mM Maleinsäure, 150 mM NaCl, pH 7,5
DIG-Puffer-2: 1% (w/v) Blocking-Reagenz (Boheringer Mannheim) in DIG-Puffer-1
DIG-Puffer-3: 100 mM Tris-HCl pH 9,5, 100 mM NaCl
Wasch-Puffer: 0,3% (v/v) Tween 20^® (Fluka) in DIG-Puffer-1
Anti-DIG-Alkalische Phosphatase-Antikörper aus Maus-Maus Hybridzellen
Streptavidin-Alkalische Phosphatase (BRL)
NBT: 4-Nitrobluetetrazoliumchlorid, 75 mg/ml in 70% Dimethylformamid (Boehringer Mannheim)
X-Phosphat: 5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-Phosphat, 50 mg/ml in Dimethylformamid (Boehringer Mannheim)

Durchführung

• Pro Sonde wird eine Verdünnungsreihe mit 5 ng, 1 ng, 100 pg, 10 pg, 1 pg, 0,1 pg der zu prüfenden, markierten DNA pro 10 µl in TE-Puffer erstellt. Als Kontrolle dient Biotin- bzw. Digoxigenin-markierte Kontroll-DNA
• 1 µl von jeder Verdünnungsstufe auf die Nylon-Membran auftragen (vgl. Schema, unten) und anschließend ca. 2 min antrocknen lassen

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	5	1	100	10	1	0,1
	ng	ng	pg	pg	pg	pg
	.	.	.	.	.	.	Kontroll-DNA
	.	.	.	.	.	.	Sonde 1
	.	.	.	.	.	.	Sonde 2

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• durch zweistündiges Backen bei 80°C wird die Sonden-DNA auf der Nylon-Membran fixiert
• Alle weiteren Schritte werden bei RT und unter ständigem leichten Schütteln durchgeführt
• Nylon-Membran in einer Plastik-Box passender Größe für 5 min (30 min bei Biotin-markierten Sonden) bei RT waschen
• 15 min in DIG-Puffer-2 inkubieren
• Anti-DIG-Alkalische Phosphatase-Antikörper (1:5.000) bzw. Streptavidin-Alkalische Phosphatase-Antikörper (1:1.000) in 5 ml mit DIG-Puffer-2 verdünnen
• Nylon-Membran zweimal je 15 min mit Wasch-Puffer spülen
• Farblösung aus 5 ml DIG-Puffer-3, 22,5 µl NBT und 17,5 µl X-Phosphat (bzw. BCIP) ansetzen
• Nylon-Membran 3 min in DIG-Puffer 3 äquilibrieren
• Farblösung gleichmäßig über die Nylon-Membran verteilen und lichtdicht abgedeckt stehen lassen
• Nach 5 min, 10 min und 45 min die Anzahl der erkennbaren Präpzipitate (Dots) kontrollieren und dokumentieren
• Farbreaktion durch Zugabe von techn. Ethanol stoppen

Sonden, bei denen sich 10 bis 25 pg und weniger markierte Sonden-DNA mit dieser Methode nachweisen ließen, wurden als ausreichend gut markiert erachtet und für die weiteren Experimente verwendet.