DAPI-Färbung
Nach der Detektion wurden die Chromosomen mit dem DNA-spezifischen Fluoreszenzfarbstoff 4',6-Diamidin-2-phenyl-indol (DAPI) gefärbt und für die Untersuchung eingebettet. Die verwendeten Einbettmedien enthielten spezielle Substanzen wie Diazabicyclo[2.2.2]octan (DABCO), die das Ausbleichen der Fluoreszenzsignale hinauszögern und damit stabiler machen.
Chemikalien und Lösungen
DABCO: Diazabicyclo[2.2.2]octan (Sigma)
DAPI: 4',6-Diamidin-2-phenyl-indol 2HCl H20 (Serva)
Glycerin für die Fluoreszenzmikroskopie (Merck, 4095)
DAPI-Stammlösung: 0,2 mg/ ml in Aqua dest.
DAPI-Färbelösung: 20 µl DAPI-Stammlösung und 20 µl
PI-Stammlösung in 60 ml PBS-Puffer
Einbettmedien waren entweder (a) Vectashield (Serva) oder (b) 1 Teil Tris-HCl
pH 7,4 und 9 Teile Glycerin mit 2,3% (w/v) DABCO und 0,02% NaN3
Durchführung
Die Präparate wurden mit einem Axioplan (Zeiss) in Epifluoreszenz untersucht. Dazu wurden je nach Farbstoff die entsprechenden Filtersätze verwendet (Tabelle 6).
Tabelle 6: Verwendete Fluoreszenz-Filtersätze
Fluoreszenzfarbstoff |
Filtersatz |
|---|---|
DAPI |
Zeiss 02 |
DAPI und Propidiumiodid |
Zeiss 02 |
FITC |
Zeiss 17 (Schmalband-Filter) |
TRITC und Cy3 |
Zeiss 15 |
Zur Dokumentation der mikroskopischen Bilder wurden zwei verschiedene Systeme eingesetzt. Die intensive und stabile Fluoreszenz der Fluorochrom-Bänderung ließ sich gut auf konventionellem fotografischen Wege dokumentieren, während die schwachen, schnell ausbleichenden Signale der FISH mit Hilfe einer gekühlten CCD Kamera festgehalten wurden.
Fotografie
Die Fluorochrom-Bänderung mit dem Gemisch von DAPI und Propidiumiodid wurde mit einer MC100 Kamera (Zeiss) fotografiert und auf Farbnegativfilm (Ultra 50, Agfa) oder Diafilm (Elite II 100, Kodak) aufgenommen. Anschließend wurden die Papierabzüge mittels eines Flachbettscanners (Argus II, Agfa) bei 600 dpi bzw. die Dias mit einem Filmscanner (Photo Scanner, Hewlett Packard) bei 1200 dpi in einen Personal Computer eingescannt. Nach Anpassung von Helligkeit und Kontrast wurden und die Einzelbilder der Chromosomen mit einem Bildbearbeitungsprogramm (Photoshop, Adobe) elektronisch zu Bildtafeln montiert.
Elektronische Bilderfassung und Bildbearbeitung
Die Dokumentation der Signale der FISH erfolgte mit einer gekühlten 12 bit Schwarzweiß CCD-Kamera (CH250A, Kodak CCD Chip KAF1400, Grade 3, Auflösung 1317 x 1035 Pixel, Pixel-Größe 6,8 x 6,8 µm, Photometrics). Diese besitzt selbst im Vergleich zu höchstempfindlichen fotografischen Filmen mit 3200 ASA noch eine ca. 1000fach höhere Lichtempfindlichkeit (pers. Mitteilung, Photometrics), und erlaubt daher Aufnahmen von extrem schwachen Fluoreszenzsignalen. Die Aufnahmen der CCD-Kamera wurden mit einem Macintosh Computer (Quadra 650, Apple) von dem Bildverarbeitungsprogramm IPLab Spectrum (Signal Analytics) gesteuert. Typischerweise wurden die einzelnen Schwarz-Weiß-Bilder dann mit Hilfe der Programm-Erweiterung "Multiprobe" von IPLab Spectrum einzeln in Rot, Grün oder Blau eingefärbt, die Signalverschiebung korrigiert, Helligkeit und Kontrast angepaßt und die Einzelaufnahmen zu einem überlagerten Bild zusammengefügt, um die Position der Hybridisierungssignale auf den Chromosomen zu zeigen. Die Erstellung der Bildtafeln erfolgte mit dem Bildbearbeitungsprogramm (Photoshop, Adobe). Die Parameter der Präparate und Aufnahme wurden mit dem Datenbankprogramm FileMaker Pro (Claris) in einer eigens dazu erstellten Datenbank verwaltet.