VORBEHANDLUNGEN

RNase-Verdau

Vorbereitung

• RNase-Lösung auftauen
• Feuchte Kammer im Wärmeschrank auf 37°C vorwärmen

Durchführung

• 30 µl RNAse-Lösung pro OT auftropfen und DG auflegen
• Präparate 45 min in feuchter Kammer bei 37°C inkubieren [70 ml PBS in Wasserbad auf 60°C vorwärmen]
• Präparate 30 min in PBS bei 60°C spülen
• OT 2 mal 5 min in frischem PBS (RT) spülen bzw. abkühlen lassen

Pepsin/HCl-Vorbehandlung

Vorbereitung

• 70 mL Pepsin/HCl-Lösung frisch ansetzen
• Wasserbad auf 37°C vorwärmen

Durchführung

• OT 2 mal kurz in 0.1 N HCl bei RT spülen
• Präparate 3 h in Küvette mit Pepsin/HCl-Lösung bei 37°C inkubieren
• OT 2 mal kurz in 0.1 N HCl und 1 mal kurz in BT-Puffer bei RT spülen
• Präparate in aufsteigende Ethanolreihe (5 min je Stufe) entwässern und an der Luft trocknen

Material

• Glasküvetten, Wasserbad für 37-70°C, Exsikkator
• 200µl Pipette mit autoklavierten Spitzen
• "Feuchte Kammer"

Chemikalien und Lösungen

• aufsteigende Ethanolreihe: 70%, 85% und 99% vergällten Ethanol
• 0.1 N HCl
• PBS: 0.13 NaCl, 0.007 M NaH2PO4, 0.003 M Na2HPO4, pH 7.4
• Pepsin porcine, 17 milliAnson U/mg, 2x cryst. lyophil (SERVA 31820)
• Pepsin-Lösung: 1 mg Pespin/mL in 0.1 N HCl
• RNase-Lösung: 100 µg/ml, DNase-frei in Aqua dest.